基因疗法在治疗许多遗传疾病方面有着非常不错的前景，但宿主免疫反应对基因治疗构成了一定挑战。虽然腺相关病毒(AAV)载体比其他病毒载体（如腺病毒)的免疫原性低，但临床前和临床研究已经证明了AAV载体给药的剂量依赖性炎症，针对基因药物的炎症反应可降低药效，且有可能导致严重临床毒性。例如，眼部AAV治疗导致的眼内炎症可致视力永久性降低；肝脏定向治疗导致肝脏转氨酶升高，引发的肝脏免疫反应致凝血因子IX(FIX)转基因表达下降，这可能是由于AAV衣壳特异性细胞毒性T细胞破坏AAV转导的肝细胞所致。最近，在一项针对儿童X连锁肌管肌病的基因治疗试验中报道了大剂量给药AAV后患者死亡的案例（详见往期文章：AAV载体高剂量给药的安全性问题浅析），这些警示人们需加强基因治疗安全性，尤其对其介导的免疫毒性的深入研究。
哈佛大学研究人员开发了一种降低AAV基因疗法免疫反应的新方法，通过将抑制TLR9激活的短核苷酸序列（短TLR9i序列）嵌入AAV基因治疗载体基因组序列中（见图1），发挥抑制针对AAV载体的免疫反应，达到提高基因治疗疗效，同时降低其潜在毒性的目的。相关研究成果近日发表在Science子刊《科学-转化医学》杂志上（Chan, Ying Kai, et al. "Engineering adeno-associated viral vectors to evade innate immune and inflammatory responses." Science Translational Medicine 13.580 (2021).）。
当AAV载体进入人体细胞后，体内抗原提呈细胞（例如DC、巨噬细胞等）经模式识别受体（例如TLR9、TLR2等）检测识别到AAV载体上的病原体相关分子模式，激活下游的相关信号通路，活化NF-κB（nuclear factor kB）、IRF（IFN-regulatory factor）等转录因子，它们分别在诱导促炎证因子及I型IFN方面发挥核心作用，上述信号通路激活诱导的细胞因子可刺激抗原提呈细胞的成熟，上调MHC及其一些共刺激因子的表达。当抗原提呈细胞迁移至淋巴结后，将AAV载体抗原肽提呈给淋巴细胞，致敏抗原特异性T细胞，激活特异性免疫反应。（详见往期文章：基因治疗载体AAV引起的固有免疫应答概述）阻断TLR9激活的一种策略是使用特定的短DNA寡核苷酸，通常为12至24个核苷酸(称为TLR9i)来拮抗TLR9的激活，TLR9i序列的加入有助于减少病毒和非病毒DNA的免疫原性。TLR9i寡核苷酸在TLR9上的结合位点与CpG DNA部分重叠，并且被测试的TLR9i寡核苷酸对TLR9的结合亲和力高于CpG DNA，TLR9i序列与TLR9的结合可竞争CpG基序的结合，以此来减少TLR9途径的免疫应答。在文献中，TLR9i序列作为一种独立药物被广泛用于抑制免疫反应测试实验，但这种策略可能需要大量的寡核苷酸来抑制所有TLR9分子，我们推测这在临床应用中使用可能不太现实。本研究中，研究人员设想将短TLR9i序列整合嵌入到较长的DNA链中，也许TLR9i序列仍旧可以保持免疫抑制活性，若果真如此，便可将短TLR9i序列嵌入AAV基因治疗载体基因组序列中，发挥抑制针对AAV载体的免疫反应，达到提高基因治疗疗效，同时降低其潜在毒性的目的。（关于TLR相关的免疫信号通路、分子表达谱及其介导的免疫反应等基础知识详见往期文章：基因治疗载体AAV引起的固有免疫应答概述。相关基础知识的理解或熟悉对理解本文的试验设计思路很有帮助）。图1. 静脉注射scAAV8后小鼠免疫应答和hFIX表达情况研究人员构建的含炎症抑制寡核苷酸TLR9i序列（简写为io1）的scAAV（scAAV.FIX.io1.）与阴性对照载体（scAAV.FIX）尾静脉给药（为全身给药方式）小鼠，与对照组相比，scAAV.FIX.io1.载体引发的免疫反应（抗病毒干扰素反应以及肝脏中免疫细胞的浸润）明显降低，同时明显提高了药效。（见图1）
图2. 肌肉给药ssAAV后小鼠免疫应答与目的基因表达情况此外，在肌肉注射给药且为单链AAV载体实验中，其免疫抑制趋势与双链AAV载体实验一致。与对照组相比，含io1.载体引发的固有免疫反应明显降低，同时明显提高了目的基因的表达水平。（见图2）
图3. 玻璃体给药AAV2-GFP后小鼠眼内免疫反应与目的基因GFP表达情况
图4. 视网膜下给药AAV8-GFP后猪眼内免疫反应与目的基因GFP表达情况经玻璃体（小鼠）或视网膜下（猪）给药AAV-GFP后，与对照组相比，TLR9i序列的加入抑制了眼内AAV诱导的眼内淋巴细胞浸润的程度，免疫反应的抑制明显提高了目的基因GFP的表达。（见图3与图4）综上所述：研究人员通过在不同衣壳血清型、基因组结构、启动子和目的基因、靶组织、给药途径和动物模型的实验中，直接比较了具有或不具有TLR9i序列的AAV载体，显示TLR9i序列的加入可以明显抑制免疫应答反应，提高目的基因表达水平。这种免疫调节策略可以为不同的AAV治疗提供一种通用的解决方案，指导核酸药物的设计；此方法可能有助于拓宽基因药物的目标人群范围，有助于基因治疗的更广泛临床使用。此外，此方法可以适当与其他免疫抑制策略联用，以达到最佳的免疫抑制效果。
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